Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)
Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist ein strahlungsloser Energieübertragungsprozess, bei dem die Energie des angeregten Donorzustands durch die Wechselwirkung intermolekularer elektrischer Paare in den angeregten Zustand des Akzeptors übertragen wird.Dieser Prozess beinhaltet keine Photonen und ist daher nicht strahlend.Dieser Assay hat den Vorteil, dass er schnell, empfindlich und einfach ist.
Der im FRET-Assay verwendete Farbstoff kann identisch sein.Doch in den meisten Anwendungen kommen tatsächlich unterschiedliche Farbstoffe zum Einsatz.Kurz gesagt ist die Übertragung leuchtender Resonanzenergie die Übertragung eines Dipolpaares vom Donor (Farbstoff 1) zum Akzeptor (Farbstoff 2), wenn die Donorgruppe angeregt wird.Im Allgemeinen überlappt das Emissionsspektrum der Donor-Fluorophor-Gruppe mit dem Absorptionsspektrum der Akzeptor-Gruppe.„Wenn der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren angemessen ist (10–100 A), kann die Übertragung der Fluorophorenergie vom Donor zum Akzeptor beobachtet werden.“Die Art der Energieübertragung hängt von der chemischen Struktur des Rezeptors ab:
1. Wird in molekulare Schwingung umgewandelt, das heißt, das leuchtende Licht der Energieübertragung verschwindet.(Der Rezeptor ist ein Lichtlöscher)
2. Die Emission ist intensiver als der Rezeptor selbst, was zu einer Rotverschiebung im sekundären Fluoreszenzspektrum führt.“(Rezeptoren sind leuchtende Sender).
Die Donorgruppe (EDANS) und das Akzeptorgen (DABCYL) sind einheitlich an das natürliche Substrat der HIV-Protease gebunden. Wenn das Substrat nicht getrennt wird, kann DABCYL EDANS unterdrücken und wird dann für Fluor nicht mehr nachweisbar.Nach der Trennung der HIV-1-Protease wird EDANS nicht mehr durch DABCYL gequencht und EDANS-Luciferasen können anschließend nachgewiesen werden.Die Verfügbarkeit von Proteaseinhibitoren kann durch Änderungen der Fluoreszenzintensität von EDANS überwacht werden.
FRET-Peptide sind praktische Werkzeuge zur Untersuchung der Unspezifität von Peptidasen.Da sein Reaktionsprozess kontinuierlich überwacht werden kann, stellt es eine praktische Methode zum Nachweis der Enzymaktivität dar.Der nach der Hydrolyse von Peptidbindungen durch den Donor/Akzeptor erzeugte Glanz liefert ein Maß für die Enzymaktivität bei nanomolaren Konzentrationen.Wenn das FRET-Peptid intakt ist, verschwindet der interne Blitz plötzlich. Wenn jedoch eine Peptidbindung gegenüber dem Donor/Akzeptor bricht, wird ein Blitz freigesetzt, der kontinuierlich nachgewiesen und die Enzymaktivität dann quantifiziert werden kann.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 14. August 2023