Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (Bund)
Die Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET) ist ein nicht strahlender Energieübertragungsprozess, bei dem die Energie des Spenders durch die Wechselwirkung intermolekularer elektrischer Paare in den angeregten Zustand des Akzeptors übertragen wird. Dieser Prozess betrifft keine Photonen und ist daher nicht ausgestattet. Dieser Assay hat die Vorteile, schnell, empfindlich und einfach zu sein.
Der im FRET -Assay verwendete Farbstoff kann identisch sein. In den meisten Anwendungen werden jedoch tatsächlich verschiedene Farbstoffe verwendet. Kurz gesagt, die Übertragung von leuchtendem Resonanzenergie ist die Übertragung eines Dipolpaars vom Spender (Farbstoff 1) auf den Akzeptor (Farbstoff 2), wenn die Spendergruppe angeregt ist. Im Allgemeinen überschneidet sich das Emissionsspektrum der Spenderfluorophorgruppe mit dem Absorptionsspektrum der Akzeptorgruppe. "Wenn der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren angemessen ist (10 - 100 a), kann die Übertragung von Fluorophorenergie vom Spender auf den Akzeptor beobachtet werden." Die Methode des Energietransfers hängt von der chemischen Struktur des Rezeptors ab:
1. wird in molekulare Schwingung umgewandelt, dh das leuchtende Licht der Energieübertragung verschwindet. (Der Rezeptor ist ein leichter Quencher)
2. Die Emission ist intensiver als der Rezeptor selbst, was zu einer Rotverschiebung im sekundären Fluoreszenzspektrum führt. “ (Rezeptoren sind leuchtende Emitter).
Die Spendergruppe (EDANS) und das Akzeptorgen (Dabcyl) sind einheitlich mit dem natürlichen Substrat der HIV -Protease verbunden, und wenn das Substrat nicht getrennt ist, kann Dabcyl Edans nachfragen und dann für Fluor nicht nachweisbar werden. Bei der HIV-1-Protease-Trennung wird Edans nicht mehr von Dabcyl gelöscht, und anschließend können Edans Luciferasen nachgewiesen werden. Die Verfügbarkeit von Protease -Inhibitoren kann durch Änderungen der Fluoreszenzintensität von EDANs überwacht werden.
FRET -Peptide sind bequeme Werkzeuge, um Peptidase -Nichtspezifität zu untersuchen. Da sein Reaktionsprozess kontinuierlich überwacht werden kann, bietet es eine bequeme Methode zum Nachweis der Enzymaktivität. Der nach der Hydrolyse von Peptidbindungen durch den Spender/Akzeptor erzeugte Glanz liefert ein Maß für die Enzymaktivität bei nanomolaren Konzentrationen. Wenn das FRET -Peptid intakt ist, zeigt es ein plötzliches Verschwinden des inneren Blitzes, aber wenn eine Peptidbindung gegenüber dem Spender/Akzeptor bricht, wird ein Blitz veröffentlicht, der kontinuierlich erkannt werden kann und die Enzymaktivität dann quantifiziert werden kann.
Postzeit: 2025-07-02