Festphasensynthesemethode von Melanotan I

Hintergrund

Melanotan I, auch bekannt als Afamelanotid, ist ein lineares Polypeptid bestehend aus 13 Aminosäuren, das in der pharmazeutischen Forschung eine immer wichtigere Rolle spielen wird. Die primären englischen Namen für Melanotan I sind Melanotan-1 und Afamelanotide. Als synthetisches Analogon des α-Melanozyten-stimulierenden Hormons α-MSH kann Melanotan I zur Behandlung von durch erythropoetische Protoporphyrie verursachten Lichtempfindlichkeitsstörungen eingesetzt werden. Derzeit sind die meisten Melanotan I-Produkte nur für Forschungszwecke gekennzeichnet und noch nicht für die Anwendung am Menschen vorgesehen. Bei der herkömmlichen Festphasensynthese hat die Wahl des Harzes erheblichen Einfluss auf die Kopplungseffizienz und die Endreinheit des Produkts.

Grundinformationen

Chinesischer Name: Melanotan 1
Englischer Name: Melanotan-1
Firmennummer: GT-A006
CAS-Nr.: 75921-69-6
Sequenz: SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
Summenformel: C78H111N21O19
Molekulargewicht: 1646,88

 Zubereitungsmethode

ICH. Herstellung von Fmoc-Val-Aminoharz

Schritt 1:Wiegen Sie 11,11 g (5 mmol) Ramage Amide AM-Harz mit einem Substitutionsgrad von 0,45 mmol/g ab und geben Sie es in einen Festphasenreaktor. Fügen Sie DCM hinzu, um das Harz 30 Minuten lang zum Quellen zu bringen, und lassen Sie es dann abtropfen. Dreimal mit DMF waschen. Fügen Sie eine DMF-Lösung mit 20 % Piperidin (v/v) hinzu und reagieren Sie 5 Minuten lang. Fügen Sie eine weitere 20 %ige Piperidin-DMF-Lösung hinzu und reagieren Sie 10 Minuten lang, mit einem DMF-Waschvorgang dazwischen. Nach Abschluss der Reaktion abtropfen lassen und dreimal mit DMF waschen.

Schritt 2:Lösen Sie 5,09 g Fmoc-Val-OH, 2,02 g HOBT (1-Hydroxybenzotriazol) und 2,32 ml DIC (N,N'-Diisopropylcarbodiimid) in DMF bei 0 °C. Nach vollständiger Auflösung die Mischung in die Reaktionssäule geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren lassen. Überwachen Sie den Reaktionsfortschritt mit dem Ninhydrin-Test und stellen Sie so ein negatives Ergebnis sicher. Nach Abschluss der Reaktion dreimal mit DMF waschen, um Fmoc-Val-Aminoharz zu erhalten.

II. Herstellung eines vollständig geschützten Harzpeptids von Melanotan I.

Schritt 1:20 % Piperidin in DMF-Lösung (Volumenverhältnis) zum obigen Fmoc-Val-Aminoharz hinzufügen. 5 Minuten lang reagieren lassen, dann eine weitere Portion 20 % Piperidin in DMF-Lösung hinzufügen und 10 Minuten reagieren lassen. Während des Intervalls einmal mit DMF waschen. Nach Abschluss der Reaktion im Vakuum trocknen und dreimal mit DMF waschen.

Schritt 2:Lösen Sie 5,06 g Fmoc-Pro-OH, 2,02 g HOBT (1-Hydroxybenzotriazol) und 2,32 ml DIC (N,N'-Diisopropylcarbodiimid) in DMF bei 0 °C. Nach vollständiger Auflösung die Mischung in die Reaktionssäule geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren lassen. Überwachen Sie den Reaktionsfortschritt mit dem Ninhydrin-Test (Kaiser-Test), bis ein negatives Ergebnis vorliegt. Nach Abschluss dreimal mit DMF waschen, um Fmoc-Pro-Val-Aminoharz zu erhalten.

Schritt 3:Befolgen Sie die in Schritt 2 beschriebene Methode und koppeln Sie nacheinander jede Aminosäure gemäß der Sequenz von Melanotan I. Nach Abschluss der Ac-Ser(tBu)-OH-Kopplungsreaktion dreimal mit DMF, dreimal mit DCM (Dichlormethan) und dreimal mit Methanol waschen. Unter Vakuum trocknen, um 23,89 g vollständig geschütztes Melanotan I-harzgebundenes Peptid zu erhalten.

III. Herstellung des Rohpeptids Melanotan I
23,89 g vollständig geschütztes, an Melanotan I-Harz gebundenes Peptid wurden in einen Rundkolben gegeben. Bei 0 °C wurden 250 ml eines vorgefertigten Spaltungscocktails (bestehend aus TFA:Thioanisol:Phenol:Triisopropylsilan:Wasser = 82,5:7,5:5:3:2 nach Volumen) langsam unter Rühren zugegeben. Die Mischung wurde 0,5 Stunden lang bei niedriger Temperatur umgesetzt, gefolgt von einer 2-stündigen Reaktion bei Raumtemperatur. Die Spaltungslösung wurde dann unter Vakuum filtriert. Diese Lösung wurde unter Rühren langsam zu 2 l eiskaltem, wasserfreiem Diethylether gegeben. Das Rohpeptid wurde durch Filtration isoliert, dreimal mit eiskaltem Diethylether gewaschen und 8,55 g Melanotan I-Rohpeptid erhalten.

IV. Herstellung von gereinigtem Melanotan I-Peptid
Schritt 1:Lösen Sie das rohe Melanotan-I-Peptid in 100 ml gereinigtem Wasser und filtern Sie es durch eine 0,45-μm-Membran, um eine Rohpeptidlösung zu erhalten.

Schritt 2:Reinigen Sie das rohe Melanotan I-Peptid mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Verwenden Sie eine dynamische Axialkompressionssäule DAC-HB50 mit mobiler Phase A (0,05 % wässrige Trifluoressigsäurelösung) und mobiler Phase B (0,05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril). Führen Sie zur Trennung und Reinigung eine Gradientenelution durch. Erkennen Sie die Probe mit einem UV-Detektor und sammeln Sie die dem Zielpeak entsprechende Peptidlösung in Fraktionen.

Schritt 3:Erhalten Sie nach der HPLC-Reinigung 180 ml Melanotan I-Trifluoracetatlösung mit einer Reinheit von über 99 %. Konzentrieren Sie die Lösung durch Rotationsverdampfung auf 50 ml.

Schritt 4:Äquilibrieren Sie die Chromatographiesäule mit entionisiertem Wasser und laden Sie 50 ml der gereinigten Melanotan-I-Trifluoracetatlösung (Reinheit >99 %). 50 Minuten lang in einem 2 %igen wässrigen Essigsäurelösungssystem eluieren. Konzentrieren Sie das gesammelte Zielprodukt mittels Rotationsverdampfung auf 80 ml. Führen Sie eine Vorgefriertrocknung und Gefriertrocknung durch, um letztendlich 5,33 g gereinigtes Melanotan I-Peptid mit einer Ausbeute von 32,33 % zu erhalten.