Peptide sind eine Klasse von Verbindungen, die durch die Verbindung mehrerer Aminosäuren durch Peptidbindungen entstehen.Sie sind in lebenden Organismen allgegenwärtig.Bisher wurden Zehntausende Peptide in lebenden Organismen gefunden.Peptide spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der funktionellen Aktivitäten verschiedener Systeme, Organe, Gewebe und Zellen sowie bei Lebensaktivitäten und werden häufig in der Funktionsanalyse, Antikörperforschung, Arzneimittelentwicklung und anderen Bereichen eingesetzt.Mit der Entwicklung der Biotechnologie und der Peptidsynthesetechnologie wurden immer mehr Peptidarzneimittel entwickelt und in der Klinik eingesetzt.
Es gibt eine Vielzahl von Peptidmodifikationen, die einfach in Postmodifikation und Prozessmodifikation (unter Verwendung abgeleiteter Aminosäuremodifikationen) sowie N-terminale Modifikation, C-terminale Modifikation, Seitenkettenmodifikation, Aminosäuremodifikation, Skelettmodifikation usw. unterteilt werden können. usw., abhängig von der Modifikationsstelle (Abbildung 1).Als wichtiges Mittel zur Änderung der Hauptkettenstruktur oder der Seitenkettengruppen von Peptidketten kann die Peptidmodifikation die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Peptidverbindungen wirksam verändern, die Wasserlöslichkeit erhöhen, die Wirkungszeit in vivo verlängern, ihre biologische Verteilung ändern und die Immunogenität beseitigen , toxische Nebenwirkungen reduzieren usw. In diesem Artikel werden mehrere wichtige Peptidmodifikationsstrategien und ihre Eigenschaften vorgestellt.
1. Zyklisierung
Zyklische Peptide finden in der Biomedizin viele Anwendungen und viele natürliche Peptide mit biologischer Aktivität sind zyklische Peptide.Da zyklische Peptide tendenziell starrer sind als lineare Peptide, sind sie gegenüber dem Verdauungssystem äußerst resistent, können im Verdauungstrakt überleben und weisen eine stärkere Affinität zu Zielrezeptoren auf.Die Zyklisierung ist der direkteste Weg, zyklische Peptide zu synthetisieren, insbesondere für Peptide mit großem Strukturgerüst.Je nach Cyclisierungsmodus kann er in Seitenketten-Seitenkettentyp, Terminal-Seitenkettentyp und Terminal-Terminal-Typ (End-to-End-Typ) unterteilt werden.
(1) Sidechain-zu-Sidechain
Die häufigste Art der Seitenketten-zu-Seitenketten-Cyclisierung ist die Disulfidbrücke zwischen Cysteinresten.Diese Zyklisierung wird dadurch eingeleitet, dass ein Paar Cysteinreste entschützt und dann oxidiert wird, um Disulfidbindungen zu bilden.Eine polyzyklische Synthese kann durch selektive Entfernung von Sulfhydryl-Schutzgruppen erreicht werden.Die Cyclisierung kann entweder in einem Lösungsmittel nach der Dissoziation oder auf einem Harz vor der Dissoziation erfolgen.Die Zyklisierung auf Harzen ist möglicherweise weniger effektiv als die Lösungsmittelcyclisierung, da die Peptide auf Harzen nicht ohne weiteres zyklische Konformationen bilden.Eine andere Art der Seitenketten-Seitenkettencyclisierung ist die Bildung einer Amidstruktur zwischen einem Asparaginsäure- oder Glutaminsäurerest und der Basisaminosäure, was erfordert, dass die Seitenkettenschutzgruppe entweder selektiv vom Polypeptid entfernt werden kann auf dem Harz oder nach Dissoziation.Die dritte Art der Seitenketten-Cyclisierung ist die Bildung von Diphenylethern durch Tyrosin oder p-Hydroxyphenylglycin.Diese Art der Zyklisierung kommt in Naturprodukten nur in mikrobiellen Produkten vor, und Zyklisierungsprodukte haben oft potenziellen medizinischen Wert.Die Herstellung dieser Verbindungen erfordert einzigartige Reaktionsbedingungen, weshalb sie bei der Synthese herkömmlicher Peptide nicht oft verwendet werden.
(2) Terminal-zu-Seitenkette
Die Cyclisierung der terminalen Seitenkette umfasst normalerweise den C-Terminus mit der Aminogruppe der Lysin- oder Ornithin-Seitenkette oder den N-Terminus mit der Asparaginsäure- oder Glutaminsäure-Seitenkette.Andere Polypeptid-Zyklisierungen erfolgen durch die Bildung von Etherbindungen zwischen terminalem C und Serin- oder Threonin-Seitenketten.
(3) Terminal- oder Head-to-Tail-Typ
Kettenpolypeptide können entweder in einem Lösungsmittel zyklisiert oder durch Seitenkettencyclisierung an einem Harz fixiert werden.Bei der Lösungsmittelzentralisierung sollten niedrige Peptidkonzentrationen verwendet werden, um eine Oligomerisierung der Peptide zu vermeiden.Die Ausbeute eines synthetischen Kopf-Schwanz-Ringpolypeptids hängt von der Sequenz des Kettenpolypeptids ab.Bevor zyklische Peptide in großem Maßstab hergestellt werden, sollte daher zunächst eine Bibliothek möglicher verketteter Leitpeptide erstellt und anschließend zyklisiert werden, um die Sequenz mit den besten Ergebnissen zu finden.
2. N-Methylierung
N-Methylierung kommt ursprünglich in natürlichen Peptiden vor und wird in die Peptidsynthese eingeführt, um die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zu verhindern und dadurch Peptide resistenter gegen biologischen Abbau und Clearance zu machen.Die Synthese von Peptiden unter Verwendung von N-methylierten Aminosäurederivaten ist die wichtigste Methode.Darüber hinaus kann auch die Mitsunobu-Reaktion von N-(2-Nitrobenzolsulfonylchlorid)-Polypeptidharz-Zwischenprodukten mit Methanol verwendet werden.Diese Methode wurde zur Herstellung zyklischer Peptidbibliotheken mit N-methylierten Aminosäuren verwendet.
3. Phosphorylierung
Phosphorylierung ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen in der Natur.In menschlichen Zellen sind mehr als 30 % der Proteine phosphoryliert.Phosphorylierung, insbesondere reversible Phosphorylierung, spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung vieler zellulärer Prozesse, wie z. B. Signaltransduktion, Genexpression, Zellzyklus- und Zytoskelettregulation sowie Apoptose.
Phosphorylierung kann an einer Vielzahl von Aminosäureresten beobachtet werden, die häufigsten Phosphorylierungsziele sind jedoch Serin-, Threonin- und Tyrosinreste.Phosphotyrosin-, Phosphothreonin- und Phosphoserin-Derivate können entweder während der Synthese in Peptide eingeführt oder nach der Peptidsynthese gebildet werden.Eine selektive Phosphorylierung kann mithilfe von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten erreicht werden, die Schutzgruppen selektiv entfernen.Einige Phosphorylierungsreagenzien können durch nachträgliche Modifikation auch Phosphorsäuregruppen in das Polypeptid einführen.In den letzten Jahren gelang die ortsspezifische Phosphorylierung von Lysin mithilfe einer chemisch selektiven Staudinger-Phosphit-Reaktion (Abbildung 3).
4. Myristoylierung und Palmitoylierung
Die Acylierung des N-Terminus mit Fettsäuren ermöglicht die Bindung von Peptiden oder Proteinen an Zellmembranen.Die myridamoylierte Sequenz am N-Terminus ermöglicht die gezielte Bindung von Proteinkinasen der Src-Familie und Reverse-Transkriptase-Gaq-Proteinen an Zellmembranen.Myristinsäure wurde mithilfe von Standardkopplungsreaktionen an den N-Terminus des Harzpolypeptids gebunden, und das resultierende Lipopeptid konnte unter Standardbedingungen dissoziiert und durch RP-HPLC gereinigt werden.
5. Glykosylierung
Glykopeptide wie Vancomycin und Teicolanin sind wichtige Antibiotika zur Behandlung arzneimittelresistenter bakterieller Infektionen, und andere Glykopeptide werden häufig zur Stimulierung des Immunsystems eingesetzt.Da viele mikrobielle Antigene glykosyliert sind, ist es außerdem von großer Bedeutung, Glykopeptide zur Verbesserung der therapeutischen Wirkung von Infektionen zu untersuchen.Andererseits wurde festgestellt, dass die Proteine auf der Zellmembran von Tumorzellen eine abnormale Glykosylierung aufweisen, wodurch Glykopeptide eine wichtige Rolle in der Krebs- und Tumorimmunabwehrforschung spielen.Glykopeptide werden nach der Fmoc/t-Bu-Methode hergestellt.Glykosylierte Reste wie Threonin und Serin werden häufig durch Pentafluorphenolester-aktivierte fMOCs in Polypeptide eingeführt, um glykosylierte Aminosäuren zu schützen.
6. Isopren
Die Isopentadienylierung erfolgt an Cysteinresten in der Seitenkette nahe dem C-Terminus.Protein Isopren kann die Affinität der Zellmembran verbessern und eine Protein-Protein-Wechselwirkung bewirken.Isopentadienierte Proteine umfassen Tyrosinphosphatase, kleine GTase, Cochaperonmoleküle, Kernlamina und zentromere Bindungsproteine.Isopren-Polypeptide können unter Verwendung von Isopren auf Harzen oder durch Einführung von Cystein-Derivaten hergestellt werden.
7. Modifikation von Polyethylenglykol (PEG).
Die PEG-Modifikation kann verwendet werden, um die hydrolytische Stabilität, Bioverteilung und Peptidlöslichkeit von Proteinen zu verbessern.Die Einführung von PEG-Ketten in Peptide kann deren pharmakologische Eigenschaften verbessern und außerdem die Hydrolyse von Peptiden durch proteolytische Enzyme hemmen.PEG-Peptide passieren den Querschnitt der glomerulären Kapillaren leichter als gewöhnliche Peptide und verringern so die renale Clearance erheblich.Aufgrund der verlängerten aktiven Halbwertszeit von PEG-Peptiden in vivo kann das normale Behandlungsniveau mit niedrigeren Dosen und weniger häufigen Peptidmedikamenten aufrechterhalten werden.Allerdings hat die PEG-Modifikation auch negative Auswirkungen.Große Mengen an PEG verhindern, dass das Enzym das Peptid abbaut, und verringern außerdem die Bindung des Peptids an den Zielrezeptor.Die geringe Affinität von PEG-Peptiden wird jedoch normalerweise durch ihre längere pharmakokinetische Halbwertszeit ausgeglichen, und da PEG-Peptide länger im Körper vorhanden sind, besteht eine größere Wahrscheinlichkeit, dass sie in das Zielgewebe aufgenommen werden.Daher sollten die Spezifikationen des PEG-Polymers optimiert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.Andererseits reichern sich PEG-Peptide aufgrund der verminderten renalen Clearance in der Leber an, was zu einem makromolekularen Syndrom führt.Daher müssen PEG-Modifikationen sorgfältiger konzipiert werden, wenn Peptide für Arzneimitteltests verwendet werden.
Gängige Modifikationsgruppen von PEG-Modifikatoren lassen sich grob wie folgt zusammenfassen: Amino(-amin)-NH2, Aminomethyl-Ch2-NH2, Hydroxy-OH, Carboxy-Cooh, Sulfhydryl(-Thiol)-SH, Maleimide-MAL, Succinimidcarbonat – SC, Succinimidacetat -SCM, Succinimidpropionat -SPA, N-Hydroxysuccinimid -NHS, Acrylat-ch2ch2cooh, Aldehyd -CHO (wie Propional-Ald, ButyrALD), Acrylbasis (-Acrylat-Acrl), Azidoazid, Biotinyl - Biotin, Fluorescein, Glutaryl-GA, Acrylathydrazid, Alkin-Alkin, p-Toluolsulfonat-OTs, Succinimidsuccinat-SS usw. PEG-Derivate mit Carbonsäuren können an n-terminale Amine oder Lysin-Seitenketten gekoppelt werden.Aminoaktiviertes PEG kann an Asparaginsäure- oder Glutaminsäure-Seitenketten gekoppelt werden.Fehlaktiviertes PEG kann an Mercaptan vollständig entschützter Cysteinseitenketten konjugiert werden [11].PEG-Modifikatoren werden üblicherweise wie folgt klassifiziert (Hinweis: mPEG ist Methoxy-PEG, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH):
(1) gerader PEG-Modifikator
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
(2) bifunktioneller PEG-Modifikator
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
(3) verzweigender PEG-Modifikator
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8. Biotinisierung
Biotin kann stark an Avidin oder Streptavidin gebunden werden, und die Bindungsstärke liegt sogar nahe an einer kovalenten Bindung.Biotin-markierte Peptide werden häufig in Immunoassays, Histozytochemie und fluoreszenzbasierter Durchflusszytometrie verwendet.Markierte Antibiotin-Antikörper können auch zur Bindung biotinylierter Peptide verwendet werden.Biotin-Markierungen werden häufig an der Lysin-Seitenkette oder dem N-Terminus angebracht.6-Aminocapronsäure wird häufig als Bindung zwischen Peptiden und Biotin verwendet.Die Bindung ist flexibel bei der Bindung an das Substrat und bindet bei sterischer Hinderung besser.
9. Fluoreszierende Beschriftung
Mithilfe der Fluoreszenzmarkierung können Polypeptide in lebenden Zellen verfolgt und Enzyme und Wirkmechanismen untersucht werden.Tryptophan (Trp) ist fluoreszierend und kann daher zur intrinsischen Markierung verwendet werden.Das Emissionsspektrum von Tryptophan hängt von der peripheren Umgebung ab und nimmt mit abnehmender Lösungsmittelpolarität ab, eine Eigenschaft, die für den Nachweis der Peptidstruktur und der Rezeptorbindung nützlich ist.Die Tryptophan-Fluoreszenz kann durch protonierte Asparaginsäure und Glutaminsäure gelöscht werden, was ihre Verwendung einschränken kann.Die Dansylchloridgruppe (Dansyl) ist stark fluoreszierend, wenn sie an eine Aminogruppe gebunden ist, und wird häufig als Fluoreszenzmarkierung für Aminosäuren oder Proteine verwendet.
Die Fluoreszenzresonanzenergieumwandlung (FRET) ist für Enzymstudien nützlich.Wenn FRET angewendet wird, enthält das Substratpolypeptid normalerweise eine fluoreszenzmarkierende Gruppe und eine fluoreszenzlöschende Gruppe.Markierte fluoreszierende Gruppen werden durch den Quencher durch nicht-photonenhafte Energieübertragung gelöscht.Wenn das Peptid vom betreffenden Enzym dissoziiert, emittiert die Markierungsgruppe Fluoreszenz.
10. Käfigpolypeptide
Käfigpeptide verfügen über optisch entfernbare Schutzgruppen, die das Peptid vor der Bindung an den Rezeptor schützen.Bei Einwirkung von UV-Strahlung wird das Peptid aktiviert und stellt seine Affinität zum Rezeptor wieder her.Da diese optische Aktivierung zeitlich, amplituden- oder ortsabhängig gesteuert werden kann, können Käfigpeptide zur Untersuchung von in Zellen ablaufenden Reaktionen verwendet werden.Die am häufigsten verwendeten Schutzgruppen für Käfigpolypeptide sind 2-Nitrobenzylgruppen und deren Derivate, die über schützende Aminosäurederivate in die Peptidsynthese eingeführt werden können.Als Aminosäurederivate wurden Lysin, Cystein, Serin und Tyrosin entwickelt.Aspartat- und Glutamatderivate werden jedoch aufgrund ihrer Anfälligkeit für Zyklisierung während der Peptidsynthese und -dissoziation nicht häufig verwendet.
11. Polyantigenes Peptid (MAP)
Kurze Peptide sind normalerweise nicht immun und müssen an Trägerproteine gekoppelt werden, um Antikörper zu produzieren.Polyantigenes Peptid (MAP) besteht aus mehreren identischen Peptiden, die mit Lysinkernen verbunden sind, die spezifisch hochwirksame Immunogene exprimieren und zur Herstellung von Peptid-Trägerprotein-Couplets verwendet werden können.MAP-Polypeptide können durch Festphasensynthese auf MAP-Harz synthetisiert werden.Eine unvollständige Kopplung führt jedoch zu fehlenden oder verkürzten Peptidketten an einigen Zweigen und weist daher nicht die Eigenschaften des ursprünglichen MAP-Polypeptids auf.Alternativ können Peptide separat hergestellt und gereinigt und dann an MAP gekoppelt werden.Die an den Peptidkern gebundene Peptidsequenz ist genau definiert und lässt sich leicht durch Massenspektrometrie charakterisieren.
Abschluss
Die Peptidmodifikation ist ein wichtiges Mittel zur Gestaltung von Peptiden.Chemisch modifizierte Peptide können nicht nur eine hohe biologische Aktivität aufrechterhalten, sondern auch die Nachteile der Immunogenität und Toxizität wirksam vermeiden.Gleichzeitig können Peptide durch chemische Modifikation mit einigen neuen hervorragenden Eigenschaften ausgestattet werden.In den letzten Jahren wurde die Methode der CH-Aktivierung zur Nachmodifizierung von Polypeptiden rasch weiterentwickelt und viele wichtige Ergebnisse erzielt.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 20. März 2023